超分辨率顯微鏡顯示驚人的細節

使用傳統的光學顯微鏡,光的衍射將成像分辨率限制在約250納米。在下面提到的一種方法中,超分辨率技術有時可以將其提高10倍或更多。今天,這項技術涉及多種方法,但主要有三種:單分子定位顯微鏡,包括光活化定位顯微鏡(PALM)和隨機光學重建顯微鏡(STORM); 結構照明顯微鏡(SIM),雖然一些專家指出,SIM的分辨率只能與良好的共聚焦顯微鏡相媲美; 和受激發射損耗顯微鏡(STED)。

“不幸的是,决定采用哪种超分辨率方法并没有简单的规则,”英国牛津大学的Henry Wellcome博士后,Mathew Stracy说。“每个人都有自己的优点和缺点。”

科学家们使用各种技术为特定项目选择正确的方法。“找到解决问题的**简单的解决方案,”海法以色列理工学院Technion生物医学工程助理教授Yoav Shechtman说。“在生物成像环境中,关键考虑因素包括:所需的空间和时间分辨率,对光损伤的敏感性,标记能力,样品厚度 - 这是2D还是3D问题? - 背景荧光水平,或细胞自发荧光。”

超級資源的ABCs

超分辨率显微镜的形式以不同的方式工作。例如,对于PALM和STORM,在任何给定时刻,只有一小部分分子上的荧光标记被打开或光活化,从而允许它们以高精度独立定位。对所有荧光标记执行此过程可构建完整的超分辨图像。“PALM / STORM系统相对容易构建,但更难以应用,因为荧光团必须是可光活化的,”马克斯普朗克生物物理化学研究所主任,2014年诺贝尔化学奖获得者之一Stefan Hell说。用于超分辨率成像。“他们的局限在于他们需要在细胞背景中检测单个荧光分子。”他补充说,这些技术“使用的可靠性不如STED”。

使用SIM,光的幹涉圖案在成像期間在樣品上産生網格。基于傅裏葉變換的圖像和算法之間的網格轉換使用結果信息來定位特征。

STED使用激光脈沖打開熒光團,另一個打開熒光團。在樣本上掃描焦點以生成圖像。“STED的優勢在于它是一種按鍵技術,”Hell解釋道。“它幾乎可以像標准的共聚焦熒光顯微鏡一樣使用。”它還能用一些熒光團成像活細胞,如綠色或黃色熒光蛋白和矽羅丹明衍生染料。

埃默里大学的助理科学家尼尔·安东尼在考虑使用哪种超级分辨率时说,“这一切都必须逐案考虑。”他指出,PALM和STORM“对活细胞不太好” ,“但STED可用于活细胞或固定细胞。

評估參數

盡管所有超分辨率技術都超過了傳統光學顯微鏡的分辨率,但有些技術比其他技術獲得了更多的收益。SIM大致將分辨率提高一倍,降**約100納米。PALM和STORM可以解析大約15納米的特征。地獄表示,STED“可以在活細胞中提供低**30納米的空間分辨率,在固定細胞中提供15納米的空間分辨率。”

在評估具體應用時,還必須考慮單噪比。在某些情況下,較低的分辨率但較高的單噪比會産生比更好的分辨率更好的圖像,但會降低單一噪聲比。

获取图像的速度在某些应用中很重要,尤其是具有活细胞的应用。“所有的超分辨率技术都比传统的荧光成像慢,”Stracy说。“PALM / STORM是**慢的,需要数万帧才能获得单个图像,SIM每张图像需要数十帧,而STED是一种扫描技术,因此采集速度取决于视场的大小。”

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除了成像活細胞或固定細胞外,一些科學家還想知道事物是如何移動的。例如,Stracy“對觀察活細胞中生物系統的動態感興趣,而不僅僅是靜態圖像,人們通常將其與顯微鏡聯系起來。”他可以用PALM結合活細胞中的單粒子跟蹤來分析動力學。通過這種方式,Stracy說他可以“直接跟蹤標記分子,因爲它們在細胞中發揮作用。”STED加熒光相關光譜也可用于觀察標記分子在STED成像體積中移動。“另一方面,SIM不適合研究這些分子水平的動態過程,但由于它的獲取速度相對較快,因此非常適合觀察細胞中較大結構的動態,例如整個染色體,幾分鍾後,“他說。

一到一個

2017年,Hell的團隊報道了MINFLUX超分辨率顯微鏡。1 “這種超分辨率方法通常在真正的分子尺度上實現了**次空間分辨率,1納米,”Hell說。“此外,它允許跟蹤活細胞中的單個分子,其速度**少比以前任何其他方法高100倍。”

MINFLUX

MINFLUX-具有1纳米的分辨率 - 清楚地分辨出八个彼此分开约11纳米的不同分子。(图片由Francisco Balzarotti,Yvan Eilers,Klaus Gwosch,ArvidGynnå,Volker Westphal,Fernando Stefani,Johan Elf和Stefan Hell提供。)

其他科學家也宣稱了MINFLUX超分辨率顯微鏡的價值。根據Shechtman的說法,“新的應用程序和方法開發不斷湧現,但我想到了兩個令人興奮的進展。”他說,其中一個是MINFLUX。他說,在描述它的好處時,“利用一種巧妙的方法,以極高的精度和非常有限的光子預算獲得分子定位。”

作为第二个令人兴奋的近期进展,Shechtman指出,WE Moerner--也是2014年诺贝尔化学奖的超分辨率成像获奖者之一 - 以及他的斯坦福大学同事改进了成像分辨率,这可能受到各向异性发射的限制。荧光单分子。为了解决这个问题,Shechtman说,Moerner实验室的科学家们通过使用不同的激发极化来测量分子的取向及其位置。或者,他们开发了复杂的光瞳平面工程,完全消除了方向诱导的定位偏差。“ 2-4这些技术提高了定位结构的能力。

看著標簽

在許多超分辨率應用中,標簽確實有所不同,並且存在一些商業選擇。例如,总部位于德国的Miltenyi Biotec与Stefan Hell联合创办的初创公司Abberior合作,为超分辨率显微镜染料提供定制抗体结合服务。

在許多超分辨率應用中,標簽確實有所不同,並且存在一些商業選擇。

其他公司也提供适用于超分辨率显微镜的标签。例如,ChromoTek营销部门的Christoph Eckert说:“我们的Nano-Boosters非常小 - 大约15千道尔顿 - 并且具有高度特异性。”这些蛋白质与绿色和红色荧光蛋白(分别为GFP和RFP)和波形蛋白结合。结合蛋白。“结合蛋白来源于单域羊驼抗体片段,称为V H Hs或纳米体,”Eckert解释说。“这些V H Hs结构域非常小,具有优异的结合特性,并且可以在不进行批次间变化的情况下以恒定的高质量老湿影院。”

这些标签的大小在超分辨率显微镜中有所不同。与荧光染料相结合,V H Hs是超分辨率的有用工具。正如埃克特指出的那样,“小于2纳米的表位 - 标记位移可以**大限度地减少连锁误差。”他补充说,“传统检测系统的荧光团距离更远,通常为15-30纳米。”这些标签适用于一系列超级分辨率技术,包括SIM,PALM,STORM和STED。

马里兰大学医学院助理教授唐爱慧及其同事使用ChromoTek的GFP-Booster和STORM来探索神经系统的信息传递。5在突触 - 神经元交流的地方 - 作者在突触前和突触后神经元中发现了分子的纳米团簇,这些分子形成了他们所描述的纳米柱。科学家得出结论:“这种结构提示了中枢神经系统突触的简单组织原理,以维持和调节突触效率。”

超分辨率成像的版本和越来越多的方法将继续为科学家提供更接近生物学的观点。在某些情况下,生物学家甚**可以观察细胞的作用 - 同时打破可见光的衍射极限。

參考

1 Balzarotti,F,et al。“具有**小光子通量的荧光分子的纳米分辨率成像和跟踪”,Science 355:606-612,2017。[PMID:28008086 ]

2 Backer,AS,et al。“使用超分辨率显微镜和同时单分子定向测量增强DNA成像,”Optica 3:3-6,2016。[PMID:27722186 ]

3 Backlund,MP,et al。“使用宽带超曲面掩模去除单分子显微镜中取向诱导的定位偏差”,Nature Photonics 10:459-462,2016。[PMID:27574529 ]

4 Lew,MD,Moerner,WE。“方位角偏振滤波,用于精确,精确,稳定的单分子定位显微镜。”Nano Letters 14:6407-6413,2014。[PMID:25272093 ]

5 Tang,AH,et al。“跨突触纳米柱将神经递质释放与受体结合,”Nature 536:210-214,2016。[PMID:27462810 ]