超分辨率顯微鏡選項

在顯微鏡中,一個重要的持續目標是希望更清楚地看到較小的東西。由于光的衍射極限,傳統的光學顯微鏡面臨大約200-250納米的分辨率極限。爲了觀察樣品的較小特征,科學家們可以應用超分辨率顯微鏡,它可以顯示尺寸僅爲幾十微米的細節。這些用于成像樣品的新技術提供的分辨率曾經看起來太好了,不能真正打破看似牢不可破的障礙。科學家必須考慮這些方法的優缺點,然後找到**適合特定研究目標的方法。

通常,超分辨率顯微鏡包括一些不同類型的技術,例如受激發射耗盡顯微鏡(STED)。另一種超分辨率方法是單分子定位顯微鏡,包括光活化定位顯微鏡(PALM)和隨機光學重建顯微鏡(STORM)。一些科學家還將結構化照明顯微鏡(SIM)添加到超分辨率方法列表中,但其他人會說這種技術無法比共聚焦顯微鏡更好地成像。

本文將簡要介紹這些技術的工作原理。在STED顯微鏡中,激光在非常有限的區域或焦點上打開和關閉熒光標記。然後,這些激光掃描樣品以産生圖像。在某些情況下,STED可以與活細胞成像相結合。對于PALM和STORM,熒光團也不會同時被激活。以這種方式,熒光標記以可用于構建極高分辨率圖像的序列打開。然而,PALM和STORM都不是活細胞成像的理想選擇,但這些方法可以相對容易地轉變爲平台。SIM技術創建了在圖像上移動的網格狀光圖案,然後傅立葉變換用于生成圖像。

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鑒于這項技術被稱爲超級分辨率,它有多好?簡短的回答是:比普通光學顯微鏡更好。因此,這意味著超分辨率顯微鏡必須提供可以分辨小于200納米的細節的圖像。但是,有些方法比其他方法更好。SIM的分辨率約爲100納米,約爲普通光學顯微鏡的兩倍。對于STED,一些平台提供30納米分辨率的活細胞,15個細胞固定。通過PALM或STORM,科學家們可以看到僅約15納米的細節。

更好的成像不僅僅是更好的分辨率。

正如已经指出的那样,更好的成像不仅仅是关于更好的分辨率。目标是看到更小的东西,并能够描述和解释它们是什么。因此,超分辨率显微镜的信噪比也很重要。更高的信噪比可以创建更清晰的图像,而这可能是**重要的。具体的比较取决于所使用的特定平台,样品和成像条件,但差异可能很大。例如,牛津大学**成像部门经理Ian Dobbie及其同事表示,  SIM在一次比较中产生的信噪比是STED的900多倍。对于科学家来说,知道什么是signal-t0-noise是可能的,有时只需要比较几种或更多种方法。

時間考慮因素也起作用。如果科學家需要了解某些東西是如何移動的,那麽**好的選擇就是它取決于它。如果事情很重要,SIM可以非常快速地跟蹤運動,但它不能提供足夠的分辨率來對分子進行分析。STED可用于跟蹤,速度取決于圖像的大小,因爲STED掃描它。PALM和STED也可以跟蹤動態事件,但不是很快,因爲這些方法將數千個圖像合並爲一個。

除了基本技術,科學家們不斷擴展超分辨率顯微鏡的功能,這裏有幾個**近的例子。

修改方法

要真正了解生物系统如何工作,必须在上下文中查看组件,这可能需要三维(3D)成像。一些技术以高分辨率提供3D成像,但对样本不是很深。因此,LaboratoirePhotoniqueNumériqueetNanosciences的研究员Pierre Bon和他的同事开发了一种名为SELFI的方法,他们将其描述为“多细胞标本和组织中3D单分子定位的框架。”使用这种技术,科学家们成像肌动蛋白丝在样品表面下方低**50微米。在这项工作中,科学家们使用了球体 - 细胞的3D培养物 - 这些材料甚**不需要在这些深度进行成像清除。

如上所述,在某些应用中可能需要在空间和时间上进行成像。这可以通过各种方式完成,并且新方法不断涌现。**近,洛桑联邦理工学院生物医学光学实验室负责人Theo Lasser建立了一个结合3D超分辨率显微镜和3D相位成像的平台,可用于绘制细胞甚**细胞器,科学家称之为一台4D显微镜。

科学家可以购买一个,而不是建立超分辨率系统。例如,尼康老湿影院的N-SIM超分辨率显微镜可用于活细胞成像,每秒可拍摄15帧。来自奥林巴斯的科学家们可以购买IXplore SpinSR10超分辨率成像系统,该系统专为活细胞成像而设计,可提供120纳米的分辨率。尼康和奥林巴斯系统都可以在不同形式的成像之间切换。例如,奥林巴斯文献指出IXplore SpinSR10可以“在超分辨率,共焦和宽场成像之间切换。”为了探索多个细节,科学家们可以从徕卡显微系统中选择HyVolution 2,它可以提供140纳米的分辨率并成像多个荧光团。超分辨率系统甚**不需要占用大量实验室空间。例如,GE Healthcare将其DeltaVision OMX SR描述为“专门为结构化照明显微镜(SIM)超分辨率技术提供稳定平台的紧凑型成像系统”,并且可用于多种模式进行活细胞成像,包括动态图像捕获。 这只是一小部分可用选项。

在進入超分辨率顯微鏡之前,要做出的各種決策和需要考慮的技術需要科學家進行一些研究,但對研究的影響可以使時間得到很好的投入。科學家在樣本中可以辨別的細節越多,我們就能越了解周圍的世界。