熒光顯微鏡買家指南

眼見爲實,對于許多生物學家來說,他們想要看到的是通過顯微鏡觀察熒光標簽。熒光顯微鏡使得在細胞和亞細胞水平上可視化熒光蛋白或染料成爲可能,已成爲現代生物學的主力。

1852年,英国科学家乔治·斯托克斯爵士**描述了荧光的概念,其中一个分子吸收一个波长的光,然后发出更长波长的光。但这种技术是以高分辨率设想这一过程并使用它的技术。自20世纪10年代德国物理学家设计早期熒光顯微鏡以来,为了照亮细胞过程已经走过了漫长的道路。科学家们在20世纪30年代开始使用荧光染料对组织进行染色,并于1942年开始使用荧光标记的抗体。1961年发现的水母绿色荧光蛋白有助于推动该领域的发展,因为它使科学家能够标记各种有荧光的蛋白质。 

在过去的几十年中,科学家已经开发了许多基于熒光顯微鏡的方法,不仅可以对分子的位置进行成像,还可以对它们如何移动和相互作 

购买熒光顯微鏡时,科学家有很多选择可供选择,在决定之前需要考虑很多因素。本买方指南讨论了儀器如何工作,它们可以用于什么以及在为您的研究需求选择系统时应该考虑什么。 

基礎

降低到**基本的水平,熒光顯微鏡检查涉及照射具有某些波长的光谱的样品,然后检测发射的荧光团。所以这一切都始于光源。诀窍是平衡入射或激发光的强度。

它越强,从样品中获得的荧光就越多,或者发出的荧光就越多。但强烈的激发光也会损坏样品 - 甚**杀死活细胞或组织 - 或导致其中的荧光团“漂白”并随着时间变得变暗。

落射熒光顯微鏡

显微镜学家有三个主要选择:白色灯,LED或激光。弧光灯和LED照亮了所谓的落射熒光顯微鏡中的整个样品。灯是**常见的光源,含有汽化汞和放电白光等气体。然后,显微镜必须包括一个或多个滤光片,将光谱缩小到所需的波长 - 光谱的蓝绿色部分,例如,激发样品中的绿色荧光蛋白。这些显微镜一次将整个样品浸泡在光线下,因此可以将它们光漂白。在使用显微镜之前,灯泡需要一些时间进行预热,它们通常可以持续使用几百小时才会褪色并烧坏。当它们褪色时,它们提供不同的强度,使得难以精确地比较甚**几周之间进行的实验。

LED是另一種更新的選擇,越來越受歡迎。在這種情況下,每個LED在光譜的有限部分産生光,因此與使用白光時相比,需要的濾波更少。與弧光燈相比,LED需要更少的功率,持續數千小時而不會褪色,並且不需要時間來預熱或冷卻。他們還立刻將整個樣品洗淨; 然而,它們通常不像燈泡那麽強烈,因此導致光漂白的可能性較小。它們比燈便宜,價格在幾美元左右。

來自光源的激發光從二向色鏡反射,以將其引向樣品。在那裏它激發熒光團,然後發射出自己的更長波長。然後通過物鏡收集該光,這放大了圖像並且對于確定分辨率和圖像質量是**關重要的。給定的物鏡不僅具有給定的放大率(10倍,100倍等),而且還具有數值孔徑的數量。數值孔徑越高,所得圖像的分辨率和亮度越高。一些物鏡具有額外的透鏡以**小化圖像中的像差。

影響圖像的另一個因素是光線在通往該物鏡的途中經過的介質。 

如果光首先穿過空氣,然後撞擊物鏡的玻璃,一些光將在該邊界處散射,因爲空氣和玻璃具有不同的折射率。浸入介質(例如油)具有折射率以匹配物鏡並使光散射**小化。

樣品熒光團發出的光比激發光暗得多,激發光也被樣品反射。這就是爲什麽將激發光反射到樣品上的二向色鏡是重要的。它允許發射光的波長在進入顯微鏡的過程中通過,但阻擋強激發波長。發射的光還通過發射濾光器,其僅選擇所研究的熒光團的輸出波長。這些激發和發射濾光片必須與您希望使用的任何熒光團相匹配。

然後信號可以傳遞到目鏡,因此您可以查看樣品。但當然,大多數科學家都希望記錄他們所看到的內容。主要的相機選項是電子倍增電荷耦合器件(EMCCD)或互補金屬氧化物半導體(CMOS)。兩者都是敏感的數碼相機,可將入射光轉換爲電信號。EMCCD長期以來一直是標准,並且被認爲更敏感,特別是在低光條件下,但CMOS相機正在改進。它們可以提供更快的圖像采集,更大的視野和更好的分辨率。

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共聚焦顯微鏡

如落射熒光顯微鏡那样,用入射光击中整个样品意味着在所需视平面上方和下方的荧光团发光,限制分辨率。为了消除这一挑战,共聚焦顯微鏡  使用激光。使用鏡子,他們可以將光線聚焦在一個點上,因此樣品中其他地方的熒光團不會被激發。在發射端,還有一個帶針孔的屏幕,用于將光從樣品限制到所需的焦點。

在激光扫描共聚焦顯微鏡中,机器扫描平面上的激发光点,并提供比落射荧光通常提供的更清晰的图像。改变平面的水平导致在不同深度处的图像的“堆叠”,从而给出了样本的三维布置的概念。

激光扫描共聚焦顯微鏡只是共聚焦顯微鏡的一个版本。相比之下,旋转磁盘和可编程阵列显微镜可以激发来自激光或落射荧光源的激发光 - 通过多个针孔扫描图像。优点是这些系统可以更快地获得图像,这对于活细胞中的成像活动可能是**关重要的。然而,激光扫描共聚焦顯微鏡通常提供**高分辨率。

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像燈一樣,激光在成像前需要一些預熱時間,並且它們的強度**終會消失。但就像LED一樣,激光持續很長時間,也許是幾千小時。激光是**昂貴的光源,運行數千美元。

为了检测和放大弱发射光,共聚焦顯微鏡使用光电倍增管。入射光子首先击中光敏光电阴极,它吸收光子并发射电子。然后该电子与一系列电极相互作用,每个电极发射的电子多于它吸收的电子。结果是信号的放大。

表:熒光顯微鏡

公司 儀器 共聚焦 共聚焦激光掃描 細胞成像系統
BioTek儀器 Lionheart FX自动活细胞成像仪 沒有 沒有
Bio-Rad公司 ZOE熒光細胞成像儀 沒有 沒有
卡爾蔡司顯微鏡 Axio觀察者研究倒置顯微鏡 沒有 沒有 沒有
卡爾蔡司顯微鏡 Cell Observer SD旋转盘共聚焦顯微鏡 沒有 沒有
卡爾蔡司顯微鏡 燈表Z.1 沒有 沒有 沒有
卡爾蔡司顯微鏡 LSM 880共聚焦激光掃描显微镜 沒有
Etaluma Lumascope 720自动熒光顯微鏡 沒有 沒有
GE医疗保健生命科學 DeltaVision Elite 沒有 沒有
基恩士公司 BZ-X700一体化熒光顯微鏡 沒有 沒有
基恩士公司 VK-X250 3D激光扫描显微镜 沒有
徕卡顯微系統 DM IL LED组织培养显微镜 沒有 沒有 沒有
徕卡顯微系統 MZ10 F. 沒有 沒有 沒有
徕卡顯微系統 TCS系列 沒有
徕卡顯微系統 個人共焦成像系統 沒有
Logos Biosystems iRiS数字細胞成像系統 沒有 沒有
分子器件 ImageXpress Micro XLS宽场高内容筛选系统 沒有 沒有
分子器件 ImageXpress超高通量成像系統
Neutec集團公司 Multispectral Imaging / VideometerLab台式实验室分析仪 沒有 沒有
尼康儀器公司 A1系列共聚焦顯微鏡 沒有
尼康儀器公司 BioStation IM-Q定时成像系统 沒有 沒有
尼康儀器公司 C2 +共聚焦顯微鏡 沒有
尼康儀器公司 Eclipse系列 沒有 沒有 沒有
奧林巴斯 BX系列 沒有 沒有 沒有
奧林巴斯 IX系列 沒有 沒有 沒有
奧林巴斯 旋轉磁盤共聚焦 沒有 沒有
奧林巴斯 VivaView FL培养箱熒光顯微鏡 沒有 沒有
配光曲線 DC2雙通道成像系統 沒有 沒有 沒有
配光曲線 DV2雙通道同時成像系統 沒有 沒有 沒有
配光曲線 QV2多通道成像系統 沒有 沒有 沒有
賽默飛世爾科技 ArrayScan系列 沒有
賽默飛世爾科技 EVOS FL自动細胞成像系統 沒有 沒有
賽默飛世爾科技 EVOS FL細胞成像系統 沒有 沒有

應用

“现在几乎每个人都在使用荧光,” 伊利诺伊大学厄巴纳 - 香槟分校Beckman**科学与技术研究所的显微镜套件经理斯科特羅賓遜說  。“你想做的事情真的很廣泛。”

“**重要的是蛋白質定位,” 威斯康星大學麥迪遜分校Newcomb成像中心的植物學家兼主任Sarah Swanson說  。“你可以將你的GFP附加到你**喜歡的感興趣的蛋白質上,看看它在活細胞中的位置。”或者,通過將GFP連接到感興趣的啓動子,可以觀察到表達水平如何隨時間變化。

與熒光團連接的抗體也可以點亮感興趣的蛋白質。同樣,熒光標簽可以幫助科學家看到細胞和細胞器等結構的形狀。

雖然人們可以隨時固定組織並觀察它們,但活細胞成像也變得非常流行。研究人員可以隨著時間的推移跟蹤感興趣的蛋白質或結構,使他們能夠觀察到穩態活動,或者看看當他們用藥物或其他影響因素擾亂系統時會發生什麽。

對于長期的實時成像,在溫度控制和適當水平的氧氣和二氧化碳的情況下,保持細胞在顯微鏡台上舒適的腔室是**關重要的。

显微镜也已进入高通量筛选應用领域,使用自动显微镜可以在科学家参与其他地方的过程中观察多个细胞。这使研究人员能够检查药物库或各种治疗是否会影响蛋白质的位置或活性并量化其结果。对于这些类型的实验,挑战变成处理和分析所有图像。

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共定位

因为光有这么多颜色,科学家可以看到同一样品中的多种蛋白质或染料,只要它们的激发和发射波长不同。这使得可以确定感兴趣的蛋白质或膜是否共同定位 - 表明它们居住在相同的空间中并且可以相互作用或不相互作用。

另一種觀察樣品中兩種標記分子之間相互作用的方法是Förster共振能量轉移(FRET)。當兩個熒光團彼此在納米範圍內時,一個熒光團的發射可以激發另一個熒光團的熒光。“供體”熒光團的發射波長必須與“受體??”的激發光譜重疊。因此,通過用顯微鏡光激發供體,人們應該能夠觀察受體的發射。通過這種方式,科學家們可以確定兩個分子,甚**是同一蛋白質的兩個部分,彼此靠近。

研究離子

蒙特利爾麥吉爾大學的寄生蟲學家Petra Rohrbach表示,她的激光扫描共聚焦顯微鏡几乎是她所有实验的组成部分。她对疟疾寄生虫如何处理药物,将它们泵入寄生虫的酸性消化液泡以及使用活细胞成像来观察处理感兴趣。例如,她添加了荧光染料,寄生虫就像是一种有毒药物一样处理,她可以在显微镜下观察处理过程。

她還使用染料來指示鈣的濃度,膜上的電位或pH值。例如,通過用熒光染料加載寄生蟲,熒光染料隨pH變化而變色,她可以監測消化液泡的酸度。如果其pH值向中性蔓延,則消化酶將無法發揮作用。羅爾巴赫說,殺死這種寄生蟲可能部分是因爲它無法消化其食物。

Swanson也在研究植物如何对压力源做出反应时使用离子敏感染料。例如,当植物弯曲并且机械应力时,钙水平会飙升。使用能够改变荧光,向下或不同颜色的染料 - 当被钙结合时,她可以观察活植物组织中发生的情况。遗传编码的离子指示器可以执行相同的功能。

激光技巧

某些共焦顯微鏡中的激光不僅僅是成像。研究人員還利用它們來評估他們所看到的分子是如何移動的。隨著光漂白後的熒光恢複(FRAP),科學家們利用了太強的光可以破壞熒光團這一事實。他們在視野的一部分消滅熒光團,然後觀察熒光何時返回。該區域的原始熒光團消失了,因此返回的熒光必須與從其他地方遷移的新熒光團有關。這使研究人員能夠觀察擴散或主動販運的動態。

其變體是FLIP,其代表光漂白中的熒光損失。FLIP幫助科學家確定樣品的哪些區域相互連接,並允許材料在它們之間擴散。研究人員反複光漂白一個斑點,一旦它們進入就會摧毀任何熒光團。在與該斑點相互連接的地方,整體熒光逐漸減弱。通過這種方式,生物學家可以確定區域的邊界。

對于許多實驗室來說,熒光成像是他們研究的生命線。“這是我們所做的一切,實際上,”  北卡羅來納大學教堂山分校的Amy Gladfelter說  。她研究細胞質和質膜是如何組織的,並使用活細胞成像,FRAP和其他技術來了解蛋白質和細胞器如何排列和移動。她還使用先進的技術,專注于蛋白質在整個細胞中以及在細胞或體外的單個分子中移動的速度。

購物點

在试用潜在购买时需要检查很多东西。一个问题是易用性。显微镜可以并且确实带有许多铃声和口哨声,但当然这些功能仅在您需要它们的功能时才有用。那些有相当基本需求的人可能更喜欢細胞成像系統。这些简化的显微镜比传统的全功能显微镜小,易于使用,具有触摸屏界面。有些包括遮光罩,因此您无需在暗室中对细胞进行成像。这些对于与学生一起工作特别有利,他们不会被设备吓倒,并且可以专注于图像。

顯微鏡簡單或花哨,科學家應該考慮他們需要什麽樣的成像模式。

除了多种颜色的荧光之外,研究人员通常希望通过相位对比成像来观察具有透射白光的细胞。罗尔巴赫说,确切地知道细胞的边界在哪里,这总是有用的。您可以使用的颜色数量 - 例如,显微镜可以与之连接的激光线数量 - 对于那些使用许多不同荧光团的人来说也是一个重要因素。

分辨率是一個需要考慮的關鍵特性,因爲它決定了您能夠區分哪些類型的特征。由顯微鏡和使用中的物鏡決定的視場也很重要。例如,觀察神經元的科學家可能需要足夠大的視野來觀察所有樹突和軸突到達的位置,但研究細菌的研究人員可能會對較小的視野感到滿意。Robinson補充道,另一種可能性是,某些顯微鏡軟件可以自動將多個圖像拼接在一起,從而創建來自幾個小視野的大視圖。

买家需要做的另一个选择是使用直立显微镜 - 其中物镜朝下放置在舞台上的样品 - 或倒置显微镜,其中物镜朝上。倒置系统通常用于研究培养细胞,因为细胞**宽的部分是接触培养皿表面。罗宾逊说,当然,如果样本很大 - 例如用于活体显微镜检查的动物 - 只有直立的样本。

您還需要決定是否要讓目鏡透過,或者只是想要樣品的數字圖像。Rohrbach指出,有些顯微鏡缺少目鏡。

如果您无法立即负担所需的所有功能,请寻找可在实验室中更新的显微镜 - 例如,通过添加用于活细胞成像的培养箱--Robinson建议。同时,寻找在您所在地区拥有老湿影院的公司,以便您在需要时快速获得帮助。

概要

虽然光学显微镜的基礎 - 光子进入样品并在光学引导下返回 - 已有数百年历史,但熒光顯微鏡仍在不断发展。科学家和工程师正在开发更加灵活的方法来改进灵敏度和分辨率等功能。例如,超分辨率技术的出现意味着科学家们现在可以在不到200纳米的范围内区分细胞特征。

即使制造商使用**新的花哨更新他们的老湿影院,他们也正在创建简化,价格合理的老湿影院,帮助实验室访问熒光顯微鏡。那些只想观察一两种蛋白质的人可能能够使用方便的細胞成像系統。对于那些考虑更**應用的人 - 例如活细胞成像,FRAP或FRET显微镜(如共聚焦系统)提供了更多选择。

科學家在購買顯微鏡時有很多選擇。問自己的關鍵問題是:“我將使用它來做什麽?”這應該讓您清楚地了解所需的功能。

编者注:我们要感谢并感谢Bio-Rad实验室全球老湿影院经理Veronika Kortisova-Descamps女士对本文的深刻讨论和贡献。