你准備好創作一件藝術品嗎?

固定細胞成像技巧

你准備好從你的免疫熒光實驗中創建令人大開眼界和可發表的圖像嗎?了解免疫熒光方案的基本步驟將幫助您生成**能傳達數據的圖像,這些提示可以使圖像成爲一件藝術品。

不幸的是,没有一种**的染色固定细胞方案,因此需要优化新抗体的方案。从长远来看,找到有关哪些条件与抗体 - 抗原组合良好协作的信息可能会有很大帮助。一点点的前期文献搜索是值得的,它节省了令人惊叹的图像。

染色細胞用于成像有六個基本步驟:樣品制備,固定,透化,阻斷,抗體孵育和安裝。以下是一些有助于優化每個步驟結果的提示。

1.樣品制備

必須具備正確培養基,血清,溫度和CO2濃度的孵育條件。另外請記住您正在生長它們的基材以及它對您的成像平台的作用。通常,這意味著在培養皿或培養皿中塗覆的蓋玻片上培養細胞,但它也可能意味著在多孔板,懸浮液瓶中或3D細胞培養物中生長。直立式顯微鏡通常需要蓋玻片上的細胞,而倒置系統也可以在多孔板或培養皿中成像細胞。

在開始免疫熒光方案之前,請始終檢查細胞的一般健康狀況和融合情況。你有足夠的細胞嗎?它們是否具有預期的形態,或者它們是否起泡,變圓或從基材上脫落?

提示#1 - 在开始优化成像之前,要知道您的细胞表达抗体的抗原。  这似乎很简单,但你会惊讶于许多研究人员在跳转到抗体 - 抗原组合的免疫荧光染色之前忘记做一个简单的蛋白质印迹。

提示#2 - 优化缓冲区。经常被忽视的优化领域之一是缓冲区选择。在固定和透化后的孵育和洗涤期间使用缓冲液; 使用正确的缓冲区可以对信号强度产生很大影响。大多数科学家自动转向PBS以满足其染色需求,但PHEM或CSK等缓冲液(通常在较低pH值下使用)可能对细胞骨架或细胞质抗原有帮助。

2.固定。

通過所有這些孵化和洗滌盡可能保持細胞完整是既棘手又極其重要的。固定是維持細胞結構的關鍵步驟。許多商業銷售的一抗已經用特定的固定劑驗證,但是新抗體需要建立優化的方案。

有兩類固定劑可供選擇:醛固定劑和有機溶劑。醛固定在細胞骨架和膜內使蛋白質彼此交聯,因此是在這些結構中標記抗原的選擇方法。然而,這種方法化學修飾蛋白質並且可以掩蓋它們,使得檢測更加困難。一個很好的起點是基于甲醛的Image-iT®固定/滲透穩定試劑盒,適用于大多數細胞類型。有機溶劑,如甲醇,乙醇和丙酮,不會通過交聯改變蛋白質,但它們會使蛋白質變性和沈澱。這種方法可能對那些具有“埋藏”抗原的抗體有益,例如在細胞核中。

提示#3-不要使用有机溶剂来固定含有荧光蛋白标签的细胞。   这可能使您标记的融合蛋白变性,使您无信号。

提示#4 - 反作用固定剂诱导的自发荧光。  一些样品易于发生固定诱导的自发荧光,这可以通过用10mM的BH 4或NH 3 Cl 还原醛基来减轻。戊二醛对自发荧光特别不利。

提示#5 - 可能需要抗原检索方法。  如果抗原被掩蔽,例如通过醛交联,则通常可以通过用热,压力和/或特殊缓冲液(例如柠檬酸盐缓冲液)处理来掩盖抗原。已经公布了对这些方法的大量评论,并且有时商业抗体来源将推荐一种方法。

3.滲透性

透化有助于通过脱脂膜使抗体通过细胞膜和固定细胞内部。有许多不同的洗涤剂可用于透化细胞,包括NP-40,Triton X-100,Tween-20和皂苷。

所需的透化程度取決于抗原的位置和所需的外顯深度。例如,如果您感興趣的蛋白質位于細胞表面或細胞外基質中,那麽您可能不需要太多透化,如果有的話。事實上,你可以通過這個程序去除膜,從而失去膜結合蛋白。然而,細胞間靶標需要一些透化方法以使抗體到達抗原。需要優化時間和濃度,但一個很好的起點是基于TritonX-100的Image-iT®固定/滲透穩定試劑盒。

提示#6-優化固定和透化方法。通過在不同的時間和濃度嘗試不同的化合物來做到這一點。您正在尋找良好的細胞或組織形態和強烈的特定染色。文獻檢索有時也可以證明是有用的。

4.阻止

由于非特异性蛋白质结合,通过阻断抗体与样品的非特异性结合,可以改善任何免疫荧光染色。牛血清白蛋白和热灭活的正常血清可用作非特异性阻断剂,并且还有一些可用于此目的的商业老湿影院,例如BlockAid TM阻断溶液。在抗体孵育之前以及在一抗孵育溶液中施加封闭溶液。

提示#7-仔细选择阻断剂。  不要使用与产生一抗的物种相同的血清。什么都不会摆脱那个背景!

提示#8-可能需要额外的阻塞解决方案。  使用Image-iT FX信号增强器可以阻止由染料电荷引起的非特异性结合。专门的方法,如酶促或生物素 - 抗生物素蛋白扩增,也需要阻断一些细胞和组织中常见的内源性过氧化物酶,磷酸酶或生物素。

5.抗體孵育

实际的检测步骤包括用**抗体和染料缀合的第二抗体沐浴细胞或组织。同样,必须仔细优化**终浓度和孵育时间,但是对于培养细胞的显微镜检查,通常在室温下在0.5-10μg/ mL的范围内持续30-60分钟。多个一抗也可以在一个步骤中组合。 

通常用针对一抗的宿主物种的染料缀合的二抗检测一抗。当组合多种一抗时,确保不同的二级抗体与其他物种交叉吸附,否则它们会交叉标记,导致信号混乱。确保使用的染料与显微镜可用的过滤器选项和/或激光线匹配,并且是具有明亮和光稳定性的染料,例如Alexa Fluor染料。

提示#9-爲您的目標使用**好的一抗。這是該過程中**重要的部分之一。如果做得好,您將獲得明亮,特定的汙漬准備出版。**的抗體將具有良好的親和力和特異性。值得研究和支付**好的抗體。如果生成自己的,請花時間設計抗體。從長遠來看,它會得到回報。確保它不老和退化!

提示#10-使用適當的控件。您將需要非初級(僅次級)對照來測試二抗的特異性。沒有抗體或染料的對照也將測試自發熒光。如果使用多種一抗,則進行單抗體對照以測試交叉標記。

5.安裝

如果您的染料之後不穩定,那麽通過所有這些步驟和優化的重點是什麽?一旦**終洗滌完成,標記的樣品將需要處于**佳保留染料信號的成像環境中。雖然細胞可以在緩沖液或緩沖液/甘油溶液中成像,但**好的選擇是將細胞置于防褪色安裝介質中,這將保留初始信號並減少光漂白(由于曝光而變暗)並且具有足夠高的折射率實現**的分辨率。

提示#11-选择**适合您成像时间线的防褪色剂。  如果您立即成像然后丢弃幻灯片,您的封固剂可以保持液态,例如SlowFade(R)Diamond。但是,如果您希望将幻灯片存档**或更长时间并在以后拍摄图像,则需要使用硬化或“固化”的固定剂,例如ProLong(R)Diamond。