选择台式離心機的技巧

液相色譜是一种广泛使用且值得信赖的样品分离方法,研究人员在目标纯化工作流程中使用该方法。分离的基础涉及移动样品(在溶液中)与固定相或固相的相互作用,所述固定相或固相将选择性地捕获,结合或与样品中的组分相互作用。色谱法  利用核酸,小分子和大分子以及蛋白质的多种化学和物理特性,从样品混合物中选择性地排除或捕获目标靶标。

基本原則

在大多数情况下,液相色譜法涉及使用填充并保持在柱中的小颗粒或树脂(也称为介质),也称为固定相。可以对这些颗粒进行物理或化学修饰,以提供在有时非常复杂的混合物中结合或排斥特定分子的特异性。这些色谱柱可以使用重力运行以移动溶液样品,但更常见的是它们在低,  中  或高压下操作 - 通过机械泵和有时专用仪器来控制样品流过色谱柱中的固定相。有多种色谱树脂可用于满足研究人员不断变化的需求,以满足不同的目标分子的需求。

液相色譜可以在分析和制备规模上进行。通过分析方法,目标通常是从复杂混合物中发现,识别并有时量化组分。制备液相色譜的重点是分离和纯化通常用于下游生物加工步骤的分子。

蛋白質純化可能帶來一些挑戰,並且與任何純化方案一樣,需要協議優化。對于培養基選擇有許多選擇,並且每種色譜方法用于不同的目的,無論是更一般的分子選擇還是高度特異性的分離。某些目標可能需要使用不同的色譜柱進行多個分離步驟,或采用多模式或混合樹脂方法來滿足研究人員的特定需求。

在这里,我们简要讨论一些用于蛋白质纯化工作流程的常见液相色譜方法,重点介绍每种方法的介质(树脂)和主要原理和注意事项。遵循的一般规则是以尽可能少的步骤获得目标蛋白质所需的纯度。

色譜和媒體選擇

離子交換色譜
离子交换(IEX)色谱法根据分子的总电荷分离分子。该技術是一种功能强大的方法,可用于纯化的分析阶段和制备阶段。离子交换树脂通过将带正电或带负电的官能团共价连接到固体基质而产生。一些常用的基质包括纤维素,琼脂糖,聚甲基丙烯酸酯,聚苯乙烯和聚丙烯酰胺。将蛋白质样品以低离子强度加载到IEX柱上,然后用增加离子强度/盐的缓冲液洗涤以除去不需要的蛋白质和杂质; 使用确定的盐梯度或pH的变化洗脱目标靶蛋白。通过盐梯度洗脱依赖于带电盐离子与带电树脂的结合靶竞争的事实。具有较少带电基团的靶标倾向于在较低盐浓度下洗脱,具有较多带电基团的靶标在较高盐浓度下洗脱。缓冲条件对于该方法是关键的,并且样品通常在低盐条件下加载到柱上。对于某些样品,这可能需要在加载到IEX色谱柱之前进行缓冲液交换步骤。或者,通过pH洗脱利用靶蛋白的等电点(pI)。当呈现给样品的pH达到目标靶的pI时,它不再带有净电荷并被树脂释放。对于某些样品,这可能需要在加载到IEX色谱柱之前进行缓冲液交换步骤。或者,通过pH洗脱利用靶蛋白的等电点(pI)。当呈现给样品的pH达到目标靶的pI时,它不再带有净电荷并被树脂释放。对于某些样品,这可能需要在加载到IEX色谱柱之前进行缓冲液交换步骤。或者,通过pH洗脱利用靶蛋白的等电点(pI)。当呈现给样品的pH达到目标靶的pI时,它不再带有净电荷并被树脂释放。
對于諸如單克隆抗體的靶標,IEX是有效的第二純化步驟; 親和色譜(見下文)通常是純化工作流程的初始步驟。對于非抗體分子,大珠IEX樹脂是**柱純化步驟的良好起點。

疏水相互作用色譜
疏水相互作用色譜(HIC)基于其疏水性分离蛋白质。HIC通常用于分离或纯化蛋白质,同时保持其生物活性,因为该技術利用比其他纯化方法对样品变性更小的缓冲液,基质和参数。盐浓度,pH和温度都可以影响与介质的结合相互作用以及固定在树脂上的配体化学。该方法是互补的,通常与上游高盐IEX洗脱或下游大小排除(见下文)纯化程序结合使用。

尺寸排阻色譜法
尺寸排阻色譜法(SEC)通过凝胶过滤基于其大小分配蛋白质。凝胶由含有特定尺寸孔的球形珠组成,所述孔包括或排除来自介质内孔的分子。当蛋白质通过柱子时,蛋白质的分离按大小发生,并按分子量降低的顺序洗脱。**常用的两种SEC方法是分馏和脱盐/缓冲交换蛋白。SEC通常用于分离可能无法通过其他方法解析的蛋白质,例如IEX或HIC。研究人员可以选择保留SEC以进行**后的纯化步骤。

親和層析
親和層析利用固定在树脂上的配体与其结合配偶体之间的特异性结合相互作用。结合/纯化通常是高度选择性的并且利用靶蛋白的生物结构或功能。该方法的典型应用包括抗体/抗原,酶/底物和酶/抑制剂相互作用。通过该方法可以纯化天然以及重组产生的分子。除了提供更高的选择性外,由于特定的相互作用,亲和色谱可以提供更快的结果时间。根据具体的纯度目标,亲和色谱通常是纯化工作流程方案中的**步,如果不是**的步骤。

多模式或混合模式色譜
多峰或混合模式色谱法利用已经用能够多重相互作用的配体官能化的树脂。当纯化不具有已知特异性的靶蛋白时,该方法是有用的。该树脂可用于筛选,纯化和潜在地鉴定靶蛋白上的位点,其可提供有用的亲和力和选择性信息。然而,由于存在多种结合和洗脱特性,因此不能通过简单的氨基酸序列分析预测目标相互作用,并且需要对结合和洗脱条件优化进行前期实验。该技術的主要优点是在单一介质中结合互补色谱方法,可以节省纯化步骤和珍贵的样品材料,同时还可以提供更快的结果时间,

蛋白質純化的許多選擇

從複雜樣品中分離目標蛋白質可能非常具有挑戰性。純化步驟是進一步表征和理解靶蛋白功能的關鍵和必要過程。優化工作流程過程涉及許多變量。通常,**好從目標的一級氨基酸序列開始。這將提供有關分子量(作爲SEC指南)和pI(作爲IEX指南)的信息,並幫助預測和“評分”蛋白質的溶解度特征。選擇合適的色譜介質以及洗滌和洗脫緩沖液條件可以極大地幫助純化過程。當目標靶的性質未被充分理解時,還存在多峰或混合模式樹脂。如需其他幫助,疏水性圖和二級結構預測也可以在考慮HIC或混合模式樹脂時提供指導。具有無序二級結構的靶(特別是在末端)通常不穩定或易于聚集,並且它們與HIC介質良好相互作用。