實驗室規模蛋白質純化

实验室规模的蛋白质纯化弥补了小规模探索性蛋白质纯化与高通量操作(如工业规模制造)之间的差距。在规模较大的一端,上游加工的进步,例如改进的发酵能力,导致可用于投入的原油样品量增加。尽管这意味着目标蛋白质的潜在产量更高,但它也对下游的及时和成本有效的样品处理提出了巨大的挑战。由于杂质含量较高导致规模增加,这一挑战变得更加困难 - 这是由于大规模细胞培养中发酵时间延长和细胞密度增加所致。

通常,在**初的探索性蛋白质纯化阶段进行了许多优化工作。在这里,您将确定您的目标蛋白质是否存在任何溶解度问题,从而缓解其中**快乐的问题,以及其纯化的基本策略。然而,在实验室规模阶段进行的工作对于在探索性和大规模蛋白质纯化之间成功转变**关重要。它使您能够研究如何增加工作量,而不会影响老湿影院回收率或纯度。

通常,许多蛋白质纯化方案依赖于色谱的应用,无论处理的体积如何。实验室规模程序也不例外,这里的色谱过程可以分为三个主要阶段:目标蛋白質捕獲,中间纯化和**終抛光[1]。这些阶段中的每一个阶段在处理工作流程中执行特定功能,因此在涉及流程设计时具有其自己独特的一组要点。同样,每个阶段在扩大规模期间都会遇到不同的挑战。本文讨论了开发實驗室規模蛋白質純化的下游工作流程时要考虑的重要因素,重点是色谱。

蛋白質捕獲

蛋白質捕獲的基本目标是尽可能快地收集和保留尽可能多的目标蛋白质,同时让不需要的杂质不受阻碍地流过分离介质。在此阶段,您选择的色谱树脂的分辨性质不如其对目标蛋白质的结合能力那么重要。

親和色譜樹脂通常用于蛋白質純化的這個階段。它們是靶蛋白富集的有效方法,可快速將它們與任何可能損害它們的雜質隔離。它們基于蛋白質對基質結合配體的吸引力而工作,並且這種相互作用可以由天然蛋白質部分介導或通過工程添加親和標簽。如果您的過程涉及外源標簽,請仔細考慮如何在淨化過程結束時將其去除。首先詢問您是否需要刪除標簽; 通過蛋白酶處理去除標簽可以爲您的方案添加**少另**。如果這是**必須的,請記住在下遊工作流程中構建純化步驟,完全刪除標簽,

如果您需要避免使用基于親和力的純化,因爲您希望避免在目標蛋白質中引入標簽,離子交換層析樹脂可能是蛋白質分離的另一種選擇。這些將在下面更詳細地討論。

無論您選擇哪種捕獲方法,請考慮此初始階段將處理**大的樣本輸入量; 因此,需要相對較快的流速來保持工作流程的效率。選擇具有良好流動特性的較大珠粒樹脂(例如,非常親水的珠粒材料)以改善整體加工時間而不損害粘合能力。當這個過程**終擴展時,這對你有利。

中間淨化

在中间纯化阶段,目标蛋白的分辨率是一个更重要的优先事项。即使在上一步中已经去除了大量杂质,一些宿主细胞污染物仍会潜伏在样品中。在这个阶段,使用具有**佳珠粒尺寸的色谱树脂可能是诱人的,因为珠粒尺寸与**终老湿影院分辨率相关; 然而,中等尺寸的珠子通常更适合于该过程的这个阶段。速度不太重要,因为任何会影响靶蛋白稳定性或活性的杂质都会在捕获步骤中被除去。但是,中等珠粒尺寸将在加工时间和纯度之间提供**佳折衷,因为它们仍然允许去除异质元素,例如电荷变体或截短蛋白质。

離子交換色譜是中間階段純化的常用選擇。它根據電荷和相反電荷矩陣的吸引力捕獲蛋白質。可以通過使用增加的離子強度或pH梯度或等度洗脫來進行分離,其中流動相保持不變但是基于極性促進物質通過基質的更快或更慢的通過。這些蛋白質分離的差異方法看到目標蛋白質在不同的洗脫窗口期間進入流動相,從而允許微調洗脫並進一步濃縮目標蛋白質。

您还应考虑在此中间阶段使用混合模式树脂。混合模式树脂由于其组成而具有独特的分离性能,其由多种分离方式组成。增加纯化过程中使用的分离方法的数量和种类会产生更高质量的**终老湿影院。使用混合模式树脂简化了这种策略,为各种生物分子提供了**的选择性和分辨率。它还能够在较高盐浓度下加载样品,具体取决于目标蛋白质和所用的混合模式树脂。这消除了对离子交换色谱通常需要的缓冲液交换或透析步骤的需要,减少了总处理时间和样品损失的可能性。

**終抛光

在色谱的**終抛光阶段,主要目标是通过去除痕量污染物来实现目标蛋白的高分离度,并将其与任何不需要的结构变体分离。对于**终的抛光色谱,也建议使用小珠粒尺寸。请注意,使用较小的珠粒尺寸会导致压力增加; 在这种情况下,应使用较低的流速,这意味着处理时间可以更长。


尺寸排阻色谱(SEC)通常用于此目的,因为它可以去除任何挥之不去的杂质,但也可以处理化学上相似但结构上不合适的蛋白质种类,例如目标蛋白质的二聚体或降解形式。顾名思义,它是一种非结合技術,根据蛋白质的大小差异分离蛋白质。使用等度缓冲液作为标准,如果您想获得**佳分辨率,重要的是要考虑SEC基质只能处理低样品量负荷(平均≤矩阵体积的10%)。

**後一句話

实验室规模的蛋白质纯化为未来的加工成功奠定了基础,因此设计一个工作流程不仅可以产生**纯净的蛋白质老湿影院,而且还可以保持未来的可扩展性。考虑在实验室规模实验中按照上述顺序使用色谱树脂。请记住,不同供应商的每种介质类别中都有各种树脂,因此在设计过程中考虑每种树脂的优缺点也是有益的。有些更适合实验室规模流程的需求。